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并非所有品系均如此。一些表达Cre 的品系即使在同窝小鼠中,Cre 表达也有可能相差甚远。另外Cre 表达呈现镶嵌
模式的品系也值得注意。使用这些小鼠你可能发现很大的实验差异,也很难重复实验结果。为了获得有价值的实验结论,
可能需要分析更多小鼠的表型。
Cre 由脑特异性的启动子驱动,那Cre 只在脑中表达吗?事实并非如此。研究发现大部分品系在其它组织中也有Cre
活性。举个列子,Emx1-Cre 小鼠除了大脑外,在肾脏和胸腺中也表达Cre。
将人雌激素受体(estrogen receptor,简称ER)的配体结合区(LBD)与Cre 重组酶相融合,形成定位于胞浆中的融合蛋白(Cre-ER)。只有在雌激素诱导后,融合的 Cre 蛋白才会通过构象变化从锚定蛋白 HSP90上解离下来,进入细胞核,识别loxP 位点并发生重组。这样就通过控制雌激素的注射时间,可以实现对基因重组时间特异性的调控。
为了避免内源雌激素的干扰,在配体结合区做一个点突变(G521R)就可以使 Cre-ER 只响应外源的人工合成雌激素(比如:Tamoxifen、4-OHT)的诱导,命名为 Cre-ERT。而另一种LBD 突变体融合蛋白被证明对4-OHT 具有远高于Cre-ERT 的敏感性,这种突变体就是大名鼎鼎的Cre-ERT2。它带有人ER LBD 中的3 个点突变:C400V/M453A/L544A。
图6. Tamoxifen 诱导Cre 作用示意图。(图片来自Inducible CreMice. Methods in Molecular Biology 530:343-63 February 2009)。
条件性基因敲除小鼠(也叫Flox 小鼠)是指在目的基因中含有成对的loxp 位点的小鼠,与Cre 工具小鼠交配后可在
特定的组织或细胞中敲除目的基因。
方案一
若Flox 小鼠与广泛表达或生殖细胞特异Cre 小鼠交配,则可以获得全身基因敲除的KO 小鼠,繁育流程如图所示。ES
打靶载体中筛选基因neo 在两个loxp 之间,不需要单独去neo,结构为5’ arm-loxp-flox-frt-neo-frt-loxp-3’ arm,直
接配生殖腺表达的Cre 可同时去除neo 基因。
图3. 由条件性基因敲除小鼠获得全身性基因敲除纯合子小鼠繁育流程。
方案二
若与组织特异性Cre 小鼠交配,则可以按照图4 所示流程进行繁殖,一般采用转入Cre 重组酶的flox 杂合子小鼠与
flox 杂合子小鼠交配的方式获得Cre 酶整合的flox 纯合子条件基因敲除小鼠。此时,一般选择同窝出生的Cre 酶未整
合的flox 纯合子小鼠作为实验对照组。
图4. 组织特异性基因敲除小鼠繁育流程1。
方案三
也可以采用图5 的方案提高实验组小鼠比例。
图5. 组织特异性基因敲除小鼠繁育流程2。
对于近交系背景的基因敲除或基因突变小鼠而言,一般采用杂合子与杂合子交配的方式获得纯合子基因敲除或突变小
鼠。此时,一般选择同窝出生的野生型或杂合子小鼠作为实验对照组。
图2. 全身性基因敲除小鼠繁育流程。
基因敲除小鼠去neo
如果基因功能可能完全丧失且基因组周边无紧邻的其他基因,可以选择不去neo;如果只是敲除某个功能域,
可能有部分功能的蛋白出现,或者敲除基因周边有其他基因存在,建议必须去neo,以免出现并不是该基因敲
除的表型。在时间充裕的情况下,为避免neo 引发的其他表型,建议去除neo 基因。
在获得转基因首建鼠之后,可以根据以下流程来建立转基因品系。
图1. 随机插入转基因小鼠建系过程。
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Piggybac 转座酶系统介导的转基因需注意
Piggybac 转座酶倾向于将目的片段插入到转录活跃的区域,大大提高了获得目的基因表达阳性Founder 鼠的
概率,但Piggybac 转座酶系统介导的基因插入存在多位点整合的可能。由于多位点整合的存在,在Founder
鼠后续传代繁育的过程中,伴随多整合位点的分离,会出现以下现象:1. 基因型鉴定阳性小鼠比例高于单位点
插入;2. 后代阳性小鼠目的基因表达量较Founder 鼠低(表达降低的量依赖于Founder 鼠中整合位点的数量
和整合位置),且相互之间不一致。故建议:每个Founder 鼠与野生型小鼠至少回交繁殖2–3 代以获得外源基
因单位点整合,且稳定表达的转基因小鼠。
哨兵鼠主要是指将背景健康的外源小鼠引入重要的繁殖饲养群体,通过直接接触目的鼠或间接接触脏垫料的方式对饲养区域进行病原微生物的检测,并替代重要饲养群体进行健康体检的一类小鼠。通常未受特定病原污染的大于 4w以上健康小鼠(免疫缺陷鼠除外)可选作哨兵鼠。哨兵鼠的品系可根据需要选择,如:ICR(CD1)、BALB/c、FVB、 C57BL/6等等。哨兵鼠一般2–3只一笼,放置于所在笼架的最后一个回风位。一般一笼哨兵动物监控60–100笼的饲养架。哨兵鼠所用的垫料为这些饲养笼中其它小鼠生活过的脏垫料大约每笼 30–50g,且必须在脏垫料内至少持续生活 4 周以上。一般国标规定三个月为一个检测周期,通过对哨兵鼠的检测,可以在不影响实验动物的情况下,实监控环境中病原体的状况,保证实验动物健康和质量标准化,保障实验研究获得可重复的结果。哨兵动物检测也有局限性对于通过空气传播的,非接触性传播的病原微生物会漏检。如仙台病毒,嗜肺巴斯德杆菌等。因此建议对于随机动物也要进行检测。
当小鼠繁殖过程出现子代数量减少、甚至不产仔的情况,可考虑是否有以下几个方面的问题:
饲养环境噪音过大:在小鼠的繁殖饲养过程中,应尽量减少噪音,保证小鼠在安静的环境中生活
孕鼠受到外界压力刺激:母鼠在怀孕后应尽量减少对孕鼠的操作和环境改变,孕鼠及哺乳期的母鼠在受到外界刺激后可能出现食仔或弃养幼仔的情况
雄鼠与雌鼠合笼时间过短:应尽量保证雄鼠雌鼠的合笼时间,以增加交配几率。另外,孕鼠临产时不要从笼中取出交配雄鼠,也不要在子代小鼠未断奶前将雄鼠重新放入繁殖笼内
增加环境暗度:避免在夜晚节律中有不必要的亮光,影响小鼠的昼夜节律
无法筑巢:在笼中提供柔软的纤维材料,如:棉絮、纸巾或软木絮等,有助于提供安全舒适的生产环境,提高产量
营养缺陷:小鼠饮食中若脂类成分过高或过低、蛋白质摄入不足或过剩都会影响小鼠生育。另外,可适当提供生育酚的来源,如:瓜子、坚果等
一般来说,至少需要 2–4 对育龄小鼠用来进行品系的繁育。若特殊品系的小鼠有生育缺陷或需要加快繁育速度,那么可以扩大交配数量。或采用 IVF 快速繁育方法,则只需要提供 2–3 只有生育能力的雄鼠即可。
小鼠资源库中的繁育代数信息说明如下:
N:表示小鼠回交代数。例如:N1 表示回交第 1 代;N2 表示回交第 2 代。
F:表示子代代数或近交代数(同窝交配)。例如:F1 表示子一代;F2 表示子二代。
p:表示所示代数为胚胎保存时的代数。例如:F3p 表示该品系在子三代时冻存了胚胎。
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