小鼠大学问 | Cre-Lox系统核心原理全解析

不论你是否直接进行过基因操作，你一定听说过Cre-lox系统。由于Cre-lox系统具有操作简单、重组率高的优点，如今已经成为体内外遗传操作的强有力工具。利用Cre-lox系统，可以在特定细胞、组织或整个生物体，甚至在特定时间点敲除或表达某个基因，实现对特定基因的时空特异性操作，这对基因功能的研究和人类疾病动物模型的建立具有深刻影响。那你对该系统了解多少呢？小编给大家准备了一系列的干货知识讲解，以供大家参考学习。本期给大家带来的是Cre-Lox系统的核心原理。


1. 什么是Cre-lox系统？


Cre-lox系统由Cre重组酶和loxp位点两部分组成。



Cre重组酶

Cre重组酶由噬菌体P1的环化重组酶基因产生的一个38 kDa的DNA重组酶，能特异性地识别Loxp位点，实现DNA片段的重组。除Cre以外，此类重组酶还有Flp（flipase）和Dre（D6特异性重组酶）。



Lox位点

lox位点是一个34bp的序列，由两个13bp的反向回文重复序列和8bp的中间间隔序列组成：ATAACTTCATGTA-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。N表示可变碱基，不同的碱基选择可形成不同的Lox位点，除了野生型loxP，常见的还有Lox2272，Lox511，Lox5171等，这些突变Lox位点也能被Cre重组酶识别，但只有两个序列相同的Lox位点之间才能发生重组。


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图1 . loxP位点及其突变体位点[1]


根据lox位点的排列方向和位置，Cre重组酶能介导片段发生删除、倒转和易位三种重组事件：

  • Deletion（删除）：当两个Lox位点在同一染色体上且方向相同时，两个Lox位点之间的序列将被删除。

  • Inversion（倒转）：当两个Lox位点位于同一染色体上且方向相反时，两个Lox位点之间的序列将发生序列倒转。

  • Translocation（易位）：当两个Lox位点位于不同的染色体上且方向相同，将导致2条染色体上DNA片段的交换。


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图2. Cre的重组机制[2]。A）loxP位点的基本结构。红色箭头指示loxP位点的方向。B）Cre-loxP介导的易位重组。C）左图示Cre介导两同向loxP位点间的切除重组。右图示Cre介导两反向loxP位点间的反转重组。


2. 体内Cre-lox系统的基础应用


利用Cre-lox系统在小鼠体内实现对基因的时空特异性打靶（表达或敲除），原则上需要建立两种小鼠。

一是Cre工具鼠，该小鼠为携带Cre重组酶的基因修饰小鼠。其中，Cre重组酶由特定启动子驱动，可在特定细胞或组织中表达；二是Flox小鼠，即在靶基因序列两侧插入Lox位点的基因修饰小鼠。通过将上述两种小鼠交配繁育，即可获得基因条件性敲除或过表达小鼠。



2.1 基因条件性表达

在基因条件性表达中，Flox小鼠的靶基因与启动子之间通常插入了一个“终止盒”（lox-stop-lox-GENE）。该元件能阻止靶基因的转录和表达。将Flox小鼠与细胞类型特异性表达Cre的工具鼠交配所获得的子代小鼠中，所有表达Cre重组酶的细胞，stop元件会被删除。因此，靶基因仅在这些特定细胞中得以表达。

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图3. 条件性基因表达小鼠原理示意图[3]



2.2 基因条件性敲除

在基因条件性表达中，Flox小鼠一般在需要删除的DNA片段两侧带有同方向的两个Lox位点（lox-GENE-lox）。将Flox小鼠与细胞类型特异性Cre小鼠交配所获得的子代小鼠中，所有表达Cre重组酶的细胞，该DNA片段会被删除。


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图4. 条件性基因敲除小鼠原理示意图[3]


3. 更精准的诱导型Cre-lox系统


为更准确地进行遗传功能研究，时间特异性的Cre-lox（也叫诱导型Cre-lox）被开发出来，可用于研究生物体发育过程特定阶段的基因功能，或用来进行谱系示踪等。常用诱导型Cre-lox系统有：



3.1 CreER系统

通过他莫昔芬（Tam）诱导Cre酶的重组活性。在没有他莫昔芬的情况下，CreER融合蛋白与热休克蛋白90（HSP90）相互作用并存在于细胞质中（图5.1）。给予他莫昔芬药物处理会破坏HSP90与CreER的相互作用（图5.2）。ER与Tam的相互作用诱导Cre的核易位（图5.3）。在细胞核中，CreER识别loxP位点（图5.4）并使组织X中的基因Y失活（图5.5）。CreERT2在体内对药物诱导的敏感性更高，因此一般优选使用CreERT2。


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图5. 他莫昔芬（Tam）诱导的Cre系统[4]



3.2 Cre;Tet系统

四环素诱导系统，也叫强力霉素（Dox，四环素衍生物）诱导的Cre系统。该系统有两种模式：Tet-on和Tet-off，分别是Dox依赖性Cre的激活和Dox依赖性Cre的失活。Tet系统包括以下元件：反向四环素控制反式激活因子（rtTA）；四环素控制反式激活因子（tTA）；四环素响应元件（TRE），通常是19个核苷酸的四环素操纵子（tetO）序列的7个重复，调节Cre基因的表达。Dox通常在小鼠的饲料或饮水中进行给药。


Cre;Tet-on系统：Dox给药才能打开Cre表达。在Tet-on系统中，表达普遍存在的或组织特异性的启动子驱动的rtTA。在没有Dox的情况下，失活的rtTA无法与负责调控Cre基因的TRE序列结合，则Cre不表达。在Dox给药之后，Dox结合并激活rtTA。激活的rtTA与TRE序列结合并诱导Cre表达。


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图6. Dox诱导的Cre;Tet-on系统[4]


Cre;Tet-off系统：Dox给药后关闭Cre表达。在Tet-off系统中，在没有Dox的情况下，激活的tTA能够结合Cre前的TRE序列并诱导Cre表达。而在Dox给药后，与Dox相互作用的tTA被灭活。灭活的rTA不再与TRE结合，因此Cre表达受到抑制。


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图7. Dox诱导的Cre;Tet-off系统[4]


4. 南模生物Cre/Dre工具鼠库

南模生物可提供超过600多种自主产权Cre/Dre工具鼠，覆盖全身各类型的细胞组织，满足科研人员多样化的需求。同时，我们还在对Cre/Dre工具鼠进行全面的验证，目前已经完成了200多种Cre/Dre工具鼠的验证工作。

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为方便大家更快的找到自己想要的Cre工具鼠，我们还特别定制了Find Cre搜索系统：https://www.modelorg.com/findcre.html。Find Cre整个界面以小鼠组织、器官和系统为主线，可分为肺、肝、胃肠道、乳腺、胰腺、感觉器官、心血管系统、免疫系统、神经系统、泌尿生殖系统、骨骼肌系统以及其他组织器官。大家选择自己感兴趣的组织器官，就可以查看该组织下可用的Cre工具鼠啦，点击这里即可快速访问。


部分Cre品系验证数据如下：


1
Alb-CreERT2

Alb-CreERT2小鼠是研究肝脏基因功能与疾病的重要小鼠品系，验证数据证明Alb-CreERT2小鼠可以成为实现肝脏时间特异性敲除或表达的工具鼠。

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图8. Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠肝组织X-gal染色。未使用他莫昔芬诱导的小鼠，肝细胞未被染色；使用他莫昔芬诱导的小鼠，肝细胞成功着色。
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图9. Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠肝组织免疫荧光检测。Alb-CreERT2; Rosa26-LacZ小鼠被他莫昔芬诱导后，LacZ（红色）表达。

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图10. Alb-CreERT2小鼠血生化检测。结果显示Alb-CreERT2小鼠与野生型小鼠相比肝功能正常。


2
Pvalb-Cre

Pvalb-Cre在中间神经元中表达iCre重组酶，而不干扰内源性Pvalb表达。这些小鼠可能对研究神经元分化有重要作用。

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图11. 荧光检测PvalbCre+/-; Rosa26tdTomato+/-小鼠大脑皮层中间神经元tdTomato的表达。


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图12. 荧光检测PvalbCre+/-; Rosa26tdTomato+/-小鼠海马中间神经元tdTomato的表达。结果显示：双阳性小鼠海马中间神经元有tdTomato的表达，表达类型符合预期。


如您有相关需求，欢迎拨打400-728-0660或于微信公众号南模生物SMOC在线咨询，我们的专业团队将竭诚为您服务！


下一期我们将深入探讨Cre-lox系统的常见问题及饲养繁育技巧，感兴趣的朋友可关注下方微信公众号，即时获取专业指导与实用干货，加速您的研究进程！



References
  1. Missirlis PI, Smailus DE, Holt RA. Ahigh-throughput screen identifying sequence and promiscuity characteristics ofthe loxP spacer region in Cre-mediated recombination. BMC Genomics.2006;7:73. Published 2006 Apr 4. doi:10.1186/1471-2164-7-73
  2. Tronche F, Casanova E, Turiault M, Sahly I, Kellendonk C. When reversegenetics meets physiology: the use of site-specific recombinases in mice. FEBSLett. 2002;529(1):116‐121. doi:10.1016/s0014-5793(02)03266-0
  3. Magnuson M , Osipovich A . Pancreas-Specific Cre Driver Lines and Considerations for Their Prudent Use[J]. Cell Metabolism, 2013, 18(1):9-20.
  4. Kim H, Kim M, Im SK, Fang S.Mouse Cre-LoxP system: general principles to determine tissue-specific roles oftarget genes. Lab Anim Res. 2018;34(4):147‐159. doi:10.5625/lar.2018.34.4.147
  5. Song AJ, Palmiter RD. Detecting and Avoiding Problems When Using theCre-lox System. Trends Genet. 2018;34(5):333‐340.doi:10.1016/j.tig.2017.12.008
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  7. Feil S, Valtcheva N, Feil R. Inducible Cre mice. Methods MolBiol. 2009;530:343‐363. doi:10.1007/978-1-59745-471-1_18
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