早期构建Cre小鼠主要采用随机转基因技术。具体而言，是将带有外源特异性启动子的Cre基因序列随机整合到小鼠基因组的某个位置。然而，采用这种方法得到的转基因小鼠，其整合位点和基因拷贝数均不可控。由于整合位置的随机性，Cre重组酶的表达可能会受到染色体状态的干扰，例如，DNA甲基化等表观遗传修饰可能会导致Cre基因的沉默，进而影响Cre重组酶的正常表达。

因此，更为可靠的方法是通过基因打靶（ES细胞或CRISPR/Cas9途径）的方式将单拷贝的Cre基因定点整合到内源基因座中。主要有以下两种：

（1）取代型表达Cre表达框直接插入到内源基因起始密码子前；

（2）共表达型的构建方式是将Cre表达框通过2A（自剪切多肽）或IRES（内部核糖体进入位点序列）元件敲入到小鼠内源基因的3'端。

图1. 取代型表达

图2. 共表达

通常我们会利用Reporter小鼠与Cre小鼠杂交来验证Cre的表达谱。Reporter小鼠一般是在Rosa26位点插入了带有lox-stop-lox终止盒以及紧随其后的报告基因。在没有Cre酶存在的情况下，报告基因不会表达。当与Cre小鼠杂交后，Cre酶会识别并切除lox-stop-lox终止盒，使报告基因得以表达，通过观察报告基因的表达情况，可推断出Cre酶的活性及其作用范围。

图3. 共表达^[1]

通常，我们希望Cre重组酶仅在特定组织/细胞中发挥作用，但其意外表达（即“异位”表达）仍然可能发生，这可能导致非预期的重组事件发生。因此，在构建Cre小鼠模型时，选择高特异性的Marker基因至关重要。这些基因可以高效、精确地驱动Cre表达，从而降低漏表达或异位表达的风险。应尽量避免使用高表达但非特异的Marker基因，以减少实验误差。

在使用Reporter小鼠验证组织特异性Cre小鼠时，常常会发现报告基因的表达比预期的更为广泛。为确认是否发生了生殖系中的Cre意外表达，可通过将不同性别的子代小鼠（Cre/+; flox/+）分别与野生型小鼠交配，以获得第二代子代。如果第二代小鼠的报告基因表达范围显著扩大，这表明很有可能发生了Cre的生殖系表达。因为Cre介导的重组可能发生在配子形成的二倍体阶段，从而导致后代即使未携带Cre，仍表现出报告基因的表达。

若Cre小鼠发生生殖系表达，使用该Cre小鼠进行条件性基因打靶时，需谨慎选择性别和交配方式。例如，母系遗传的Cre小鼠品系应使用雄性Cre阳性小鼠进行繁育，而父系遗传的Cre小鼠品系则需使用雌性Cre阳性小鼠进行繁育。此外，诱导型Cre小鼠是一种有效的解决方案，通过仅在成年期或胚胎发育晚期激活Cre重组活性，可避免生殖系的意外表达，从而获得更可靠的条件性基因打靶模型。

cKO小鼠通常需要把两个等位基因全部删除，才能达到基因敲除的目的，故其flox等位基因的基因型应该为纯合。一般情况下，Cre工具鼠一般是杂合子/半合子。（保证cre基因的拷贝数一致，避免重组效率不同导致实验可重复性差；Cre小鼠的构建方式为转基因随机插入或取代型敲入时，可能会破坏内源基因的表达，使用杂合子/半合子在一定程度上可以避免该影响。）由此可见，cKO小鼠的目标基因型一般是cre/+；flox/flox。（本文中+代表wildtype）

图4. 条件性敲除小鼠的繁育策略

首先，将Cre杂合子小鼠与flox杂合子或纯合子小鼠交配，获得的Cre与flox双阳性（Cre/+; flox/+）子代小鼠。之后，再将Cre与flox双阳性（Cre/+; flox/+）子代小鼠与flox杂合子或纯合子小鼠交配，获得所需的cre/+；flox/flox小鼠为实验组。一般对照组为同窝+/+；flox/flox小鼠。