【谱系示踪系列第一期】基础细胞标记方式
细胞谱系追踪技术通常是指使用各种手段对某类祖细胞亚群进行标记，在后续时间点对其分化命运进行检测，它对于揭开多样的、基础的生物学过程中的分子机制是非常关键，因此一直以来建立能够在体内进行追踪细胞谱系的动物模型是生物学研究的一个长期目标。
图. 谱系追踪策略[1] 自1990年代初以来，基因修饰技术一直用于细胞谱系追踪，目前已经成为了大多数谱系示踪研究的首选方法。目前，体内的遗传细胞追踪技术主要分为两种类型，一种是基于KI/TG策略，直接将报告基因与目的基因连接，以达到标记目的细胞的效果；另一种是基于 Cre-loxP 、Dre-rox 、FLP-FRT等基因位点特异性重组酶系统，利用细胞或组织特异性表达的重组酶，特异性地激活报告基因的表达，从而实现特定细胞及所有后代的永久遗传标记。 使用转基因（Tg）或基因敲入（KI）的方式，将报告基因整合进目的基因（常为目的细胞marker或细胞特异性表达的启动子），即可实现针对特定细胞的标记。 这种细胞标记的构建分为以下几种类型： 01 随机转基因
将含有报告基因的外源DNA片段克隆至PiggyBac（PB）转座子质粒中，与转座酶一起注射到小鼠受精卵中。在转座酶作用下，外源DNA片段将会被整合到基因组上的TTAA位点处，从而获得表达报告基因的小鼠。
02 基因敲入——融合表达
将报告基因敲入到小鼠内源基因的5'端或3'端，与内源基因融合表达。
03 基因敲入——共表达
将报告基因通过2A（自剪切多肽）或IRES（内部核糖体进入位点序列）元件敲入到小鼠内源基因的3'端。
04 基因敲入——取代表达
将报告基因敲入到小鼠内源基因的5'端，并取代小鼠本身的基因，使敲除和敲入同时发生。
通过KI/TG策略标记的细胞，仅可标记目前正在表达目的基因的细胞。曾经表达目的基因但现在不表达的细胞，与现在正在表达，但分化后不表达目的基因的后代细胞均不会被报告基因标记。因此，基于KI/TG策略的细胞标记适用于基因表达监测、细胞定位等无需关注目的细胞后代的研究。
基因位点特异性重组酶系统一般指通过特异位点重组酶 (site-specific recombinases, SSRs) 介导重组酶特异识别位点 (recombination target sites, RTs) 间的重组，来实现特异位点的基因敲除、基因插入、基因翻转和基因易位等操作。 基于基因位点特异性重组酶系统的细胞标记技术被广泛应用于器官发育、组织再生和疾病研究。目前，多种重组酶系统被普遍使用，例如Cre-loxP、Flp-frt和Dre-rox系统。其中使用最普遍的为Cre-loxP系统。 01 Cre-loxP系统
借助重组酶系统构建条件性表达报告基因的小鼠模型需要使用到至少两种类型的小鼠。以Cre/loxP系统为例，首先将携带报告基因的DNA序列插入到小鼠的Rosa26位点上，并在启动子和报告基因之间插入转录终止盒（loxp-stop-loxp）构建Flox鼠；同时构建特异性Cre鼠（由特定启动子驱动或连接在特定细胞marker之后，可在特定细胞或组织表达Cre重组酶）。将上述两种小鼠交配后，子代中可以获得既带有Cre又带有Flox基因的小鼠，该小鼠在表达Cre重组酶的细胞或组织中，终止盒被Cre重组酶切除，因此仅在这些细胞或组织中才会表达报告基因。
由于Cre/loxP系统介导的删除是不可逆的，转录终止盒（stop序列）被去除掉后，细胞会稳定表达报告基因。因此，当重组发生后，即使被标记的细胞的后代不表达Cre，这些后代细胞同样会被报告基因标记，即Cre策略标记的细胞来源于曾经或者正在表达Marker基因（表达Cre）的细胞。
02 CreERT2-loxP系统 为实现重组的时间与空间的双重控制，又进一步开发了CreERT2-loxP系统，可使用他莫昔芬进行诱导重组，从时间上调控Cre-loxp重组。这种方法也被称为诱导型Cre重组酶系统。 雌激素受体（estrogen receptor，ER）是雌酮、雌二醇等女性荷尔蒙的细胞内蛋白受体。在没有雌激素的情况下，雌激素受体跟胞质中的热休克蛋白90（heat shock protein 90，HSP90）结合在一起。由于热休克蛋白的阻挡，雌激素受体无法进入细胞核，只能游荡于细胞质内。雌激素出现后，雌激素受体会与雌激素结合，并与HSP90解离，后进入细胞核调控基因表达。 CreERT2就是将雌激素受体的配体结合域和Cre酶共表达，借助ERT2的特性，通过他莫昔芬调控基因重组。
基于CreERT2系统的细胞标记依赖于他莫昔芬诱导。当他莫昔芬存在时，转录终止盒（stop序列）被去除，细胞开始表达报告基因；当他莫昔芬代谢完后，基因重组不会再进行。因而，CreERT2策略标记的细胞来源于他莫昔芬代谢期中表达Marker基因（表达CreERT2）的细胞与这些细胞的后代。在他莫昔芬代谢结束后，即使表达Marker基因（表达CreERT2）的细胞也不会被报告基因标记。
总结：
除了上述外，根据重组类型和数量，基因重组系统可以分为传统的单重组酶介导的遗传方法与更复杂的单重组酶介导的多色报告系统方法和多重组酶介导的遗传方法，下一期鼠博士为大家讲解单重组酶介导的多色报告系统。 Reference： [1] Liu K, Jin H, Zhou B. Genetic lineage tracing with multiple DNA recombinases: A user's guide for conducting more precise cell fate mapping studies. J Biol Chem. 2020;295(19):6413-6424. doi:10.1074/jbc.REV120.011631 关于我们 上海南方模式生物科技股份有限公司（Shanghai Model Organisms Center, Inc.，简称"南模生物"），成立于2000年9月，是一家上交所科创板上市高科技生物公司（股票代码：688265），始终以编辑基因、解码生命为己任，专注于模式生物领域，打造了以基因修饰动物模型研发为核心，涵盖多物种模型构建、饲养繁育、表型分析、药物临床前评价等多个技术平台，致力于为全球高校、科研院所、制药企业等客户提供全方位、一体化的基因修饰动物模型产品解决方案。
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